>БИБЛИОТЕКА > РАБОТЫ ПО НЕОНАТОЛОГИИ

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия. Санкт-Петербург, Россия

   В прижизненной оценке состояния респираторного отдела лёгких ведущее место занимает бронхоальвеолярный лаваж с последующим цитологическим исследованием бронхоальвеолярных смывов. Бронхоальвеолярные смывы дают близкую к in situ цитологическую картину популяции воспалительных и иммуноэффекторных клеток. Альвеолярный макрофаг (АМ) является важнейшим и специализированным элементом в продолжении популяции клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Многочисленные исследования дают сведения о морфологии макрофагов, полученных от животных и взрослых людей, и относительно мало информации имеется в отношении макрофагов новорождённых, особенно недоношенных. Течение воспалительного процесса в лёгком и реализация механизмов защиты лёгочной ткани от повреждения во многом определяется реактивностью лёгочных макрофагов. В связи с этим важно изучить реакцию системы мононуклеарных фагоцитов в лёгких при хронических воспалительных процессах у недоношенных новорождённых. Для постановки целого ряда цитохимических реакций, характеризующих функциональную активность АМ, необходимо иметь в наличии популяцию живых клеток.
   Ведущее место среди методик выделения АМ занимает центрифугирование в прерывистых градиентах плотности различных коллоидов. Среди предложенных сред имеются альбумин, фиколл-верографин, перколл и т.д. Выпускаемый раствор коллоидного силикона Перколл^R (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) является наиболее удобной и практичной средой для повседневного использования в клинической практике.
   Целью данной работы явилась разработка наиболее приемлемой методики выделения АМ на градиенте перколла из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) недоношенных новорождённых, находящихся на искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ).

   Материал и методы. Выделение АМ проведено в 60 пробах БАЛЖ, полученной у недоношенных новорождённых, находящихся на ИВЛ.
   Подготовка раствора перколла: концентрированный раствор перколла (ρ=1,131г/мл, индекс рефракции =1,3536) изотонизируется добавлением одной части 9% раствора NaCl к девяти частям раствора перколла. Для выделения АМ избраны градиенты: ρ=1,078г/мл (наиболее используемый для выделения мононуклеаров в России) и ρ=1,048г/мл (наиболее используемый за рубежом для выделения АМ). Прерывистые градиенты перколла готовятся разведением изотонизированного раствора перколла средой Хенкса до конечной концентрации 55% (ρ=1,078г/мл, индекс рефракции=1,3455) и 35% (ρ=1,048г/мл, индекс рефракции=1,342). Плотность раствора перед использованием контролируется на рефрактометре. В центрифужную (пластиковую) пробирку наливаются градиенты перколла по 2 мл в убывающей концентрации, начиная от дна и на них, наслаивается взвесь клеток БАЛЖ (плотность суспензии клеток 2 х 10⁶ кл/мл) в объёме 2 мл. Сепарация клеток производится при комнатной температуре центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 минут. Слой АМ в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором отсасывается пастеровской пипеткой и дважды отмывается раствором Хенкса в течение 10 мин при 1500 об/мин, ресуспендируется. Идентификация клеток производится после окраски по Паппенгейму на светооптическом микроскопе. Полученные результаты представлены в таблице: